proliferaKemik Doku Mühendisliği İçin Hazırlanan Biyobozunur Poli(Ester-Üretan) İskeleler

  • Makale
  • Ziyaret: 3148
  • uretan, poli, makale, esteri, biyobozunur
  • Son Güncelleme: 22-04-2015
  • (Puanı 3.0/5 Yıldız) Toplam Oy: 4
  •  
    Share on Tumblr       


Dr. Aysel Kızıltay a, b, c, Prof. Dr. / Assoc. Prof. Dr. Nesrin Hasırcı a, c, d, e*

Orta Doğu Teknik Üniversitesi, a Biyoteknoloji Lisansüstü Programı, b Merkez Laboratuvarları, c BIOMATEN Biyomalzeme ve Doku Mühendisliği Mükemmeliyet Merkezi, d Kimya Bölümü,e Polimer Bilim ve Teknolojisi Lisansüstü Programı, f Biyomedikal Mühendisliği Lisansüstü Program


Poliüretan (PU) kimyasındaki esneklik, ana zincire, fark­lı karakteristiklere sahip çeşitli sentetik polimerlerin orta­ya çıkmasını sağlayan spesifik kimyasal yapıların eklenme­sine imkan verir [1]. Yapısındaki çeşitlilikten dolayı oto­motiv uygulamaları, organik ve su bazlı kaplamalar, kol­tuk minderi veya yalıtım için köpükler gibi çok geniş yel­pazedeki endüstriyel uygulamaların yanı sıra biyomedikal alanda da yapay damar greftleri, kateterler, yara örtüle­ri gibi uygulamalara sahiptir [2]. PU’ların temel avantajı biyouyumlu ve kan uyumlu olmalarıdır. PU’lar, genellikle bir zincir uzatıcı kullanılarak diizosiyanatların ve poliolle­rin tepkimeye girmesiyle elde edilir. Diizosiyanat ve poliol yapıların seçimi uygulamanın amacına bağlıdır. Diizosiya­natlar, çok farklı kimyasal reaktifliğe sahip aromatik veya alifatik yapılarda olabilirler [3].

 


Tıbbi uygulamalarda PU’lar biyolojik ortamda bozunma­sı istenmeyen ve vücutta kısa veya uzun süreli kalabilen tıbbi cihazların üretilmesinde onlarca yıldır kullanılmıştır. Yaygın olarak kullanılan aromatik izosiyanatların bozun­ması sonucu toksik ürünler ortaya çıkabileceğinden, biyo­bozunur (vücut içerisinde enzimler etkisi ile parçalanabi­len) PU malzemeler sınırlı kullanıma sahip olmuştur. Bu dezavantajı bertaraf etmek amacıyla bozunabilir PU esas­lı iskele yapıların sentezlenmesinde aromatik izosiyanatla­rın yerini toksik olmayan ürünlere parçalanabilen lizin etil ester diizosiyanat (LDI) veya diizosiyanatobütan (BDI) al­mıştır [4]. Doku mühendisliği uygulamalarında, iskeleler kimyasal yapılarının ve gözenekliliğin hücre yapışmasını, hücre göçünü ve hücre çoğalmasını destekleyecek ve do­layısıyla yeni doku oluşumunu ve iyileşme sürecini hızlan­dıracak şekilde üretilir. Son yirmi yılda, vücuda yerleştiril­dikten sonra zararsız moleküllere parçalanabilen PU’lar oldukça fazla ilgi çekmiştir ve bunların biyomalzeme olarak vücut içi (in vivo) ortamda biyobozunmaları ve biyouyumlulukları araştırılmıştır. Bozunabilir PU’lar ester bağlarının polimer ana zincirine dahil edilmesiyle elde edilebilir. Biyobozunur poliüretanların yumuşak segment kısmını genellikle polietilen glikol (PEG) veya polikaprolakton diol (PCL) oluşturur. PCL, düşük erime sıcaklığına sahip (ca. 60oC) kolay işlenebilir yarı kristal lineer bir poliesterdir. İnsan vücudunda güvenli kullanımından dolayı FDA onaylı olup özellikle uzun süreli implante edilebilir cihazların ve yavaş bozunmaya uğradığından doku mühendisliğine yönelik iskele yapıların hazırlanmasında ilgi çekmektedir [5,6].


Bu çalışmada, lizin diizosiyanat (LDI) ve PCL esaslı toksik olmayan, biyobozunur termoplastik poli(esterüretan) sentezlenmiştir. Lizin aminoasitinin polimer yapısına dahil edilmesinin olumlu biyolojik etkiler göstermesi beklenmiştir. Sentezlenen polimerler, kemik doku mühendisliğine yönelik iskele yapı denilen üç boyutlu (3D) hücre taşıyıcılarının hazırlanmasında kullanılmıştır. 3D iskele yapıların üretilmesinde hızlı prototipleme (biyoçizimleme) ve geleneksel tuz yıkama olarak iki teknik uygulanmıştır. Bu tekniklerle elde edilen iskele yapılar farklı basma modülü değerleri ve gözeneklilik göstermiştir. İskelelerin biyouyumluluğu, fare kemik iliğinden elde edilen kök hücreler (BMSCs) kullanılarak araştırılmıştır. Hücre kültürü deneyleri, iskelelerin hiçbir toksik etki olmaksızın kemik hücrelerinin (osteoblast) çoğalmasını desteklediğini göstermiştir.


Poli(ester üretan) (PEU) Sentezi

PEU polimeri LDI ve PCL (diol)’in dikloroetan (DCE) içerisinde ve 2etilhekzanoatın katalizör olarak varlığında kondansazyon polimerizasyonu ile sentezlenmiştir. Elde edilen polimer kloroformda çözüldükten sonra su içerisinde çöktürülüp yıkanmış ve vakumda kurutulmuştur. Üretan polimerinin oluşumu şematik olarak Şekil 1’de gösterilmiştir.

Şekil 1. PEU reaksiyon şeması


PEU 3Boyutlu İskele Yapıların Hızlı Prototipleme ve Tuz Yıkama Teknikleriyle Üretilmesi

PEU’nun fiber şeklinde katman katman fabrikasyonu Bioplotter cihazıyla (Envisiontec GmbH, Germany) gerçekleştirilmiştir. 3D iskele yapılar eritilmiş polimerin metal bir şırınga ucundan enjekte edilmesiyle ve sekiz kat fiber dizilimi şeklinde üretilmiştir. CAD/CAM yazılımı kullanılarak her bir katmanda fiberlerin yönelimi öncekine göre değiştirilerek iki farklı yapıya sahip iskeleler elde edilmiştir. Temel yapı (BPB), birbirini takip eden katmanlarda, her bir katmanın bir alltaki katmana göre dikey olarak enjekte edilmesiyle üretilmiştir. Offset (BPO) yapı ise alttaki katmana göre offset mesafede çizimlenerek üretilmiştir (Figure 2A).


PEU esaslı süngerimsi yapılar, PEU çözeltisinin liyofilizatörde kurutulmasıyla elde edilmiştir. Oldukça gözenekli yapılar elde etmek için elekten geçirilmiş tuz kristalleri (180 300 μm) dioksanla hazırlanan PEU çözeltisine eklenmiştir. Liyofilizatörde kurutulduktan sonra örnekler delgeçle kesilmiş ve tuz içerenler tuzdan arındırmak amacıyla saf su içerisinde bekletilmiştir. Hazırlanan süngerler SP0 (tuzsuz), SP5 (polimer / tuz oranı= 1:5) ve SP10 (polimer / tuz oranı= 1:10) olarak adlandırılmıştır. Bu süngerlerin taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri Şekil 2B’de gösterilmiştir.

  

 

                                            Şekil 2. 3-D iskele yapıları (A) Hızlı prototip ile (B) Tuz yıkama tekniği ile


PEU İskele Yapıların Mekanik Özellikleri ve Gözenekliliği

PEU iskele yapıların mekanik özellikleri Lloyd LRX 5K mekanik test cihazıyla çalışılmıştır. Basma deneyleri için silindir şeklindeki yapılar basma çeneleri arasına sıkıştırılmıştır. Basma modülü, gerilimgerinim eğrisinin başlangıç kısmının doğrusal elastik bölgesinden hesaplanmıştır (Tablo 1). Hızlı prototipleme ile yapılan örneklerin basma modülü değerleri, liyofilize (tuzsuz hazırlanmış) ve tuz yıkama ile elde edilmiş süngerlerin değerlerinden yaklaşık yüz kat fazla çık mıştır. Hızlı prototipleme ile üretilmiş örneklerde eritilmiş polimer enjekte edilmiştir, dolayısıyla moleküller iyi organi­ze olmuş kütle özelliğine sahip olmuştur ve sünger yapılara kıyasla daha iyi mekanik dayanım göstermişlerdir.

 


Hızlı prototipleme ile üretilen iskele yapıların gözeneklili­ği mikro-bilgisayarlı tomografi (μ-CT), süngerlerin ortala­ma gözenekliliği ise piknometre kullanılarak belirlenmiştir (Tablo 1). Hızlı prototipleme ile homojen gözenek yapısı­na sahip iskele yapılar (BP-B ve BP-O) elde edilmiştir. μ-CT görüntüleri bu iskele yapıların, tüm yapı boyunca birbirine bağlı ve kontrollü gözenek yapısına sahip olduğunu gös­termiştir (Şekil 3). Diğer yandan, liyafilizatörle elde edilen sünger yapılarda %33-96 aralığında homojen olmayan gö­zenek boyut dağılımı görülmüştür.

 

Şekil 3. Bioplotter ile hazırlanan PEU iskele yapıların yapay renklendirilmiş μ-CT görüntüleri a) İzometrik, b) Yandan görünüş


PEU İskele Yapılar Üzerinde Hücre İzolasyonu ve Hüc­re Kültürü

 

Fare kemik iliğinden elde edilen kök hücreler, hücre kültür kaplarında çoğaltılmış ve daha sonra iskele yapılar üzerine ekilmiştir. Bu işlem şematik olarak Şekil 4’te gösterilmiştir. İskele yapılar üzerinde hücre morfolojisi ve çoğalması SEM ile incelenmiştir.

                               

 

                                                           Şekil 4. Hücre izolasyonu ve hücre kültürü


Kemik iliğinden elde edilen kök hücreler hem tuz yıkama hem de hızlı prototipleme ile elde edilen iskeleler üzerinde iyi yapışma özelliği göstermiştir. Bütün iskelelerin üzerinde hücre katmanları gözlenmiştir. Hücreler komşu hücrelerle yakın şekilde tutunmuş ve yapılar üzerinde hücresel ağlar oluşturmuştur. Hızlı prototipleme örneklerinde hücrelerin fiberler arasında köprü oluşturduğu gözlenmiştir. Sonuç olarak iskele yapılar üzerindeki hücrelerin morfolojisi hücre - iskele yapı arasında iyi bir etkileşim olduğunu göstermek­tedir (Şekil 5).

Şekil 5. İskeleler üzerinde hücre yapışması ve yayılması (a) Tuz Yıkama ile yapılan süngerimsi iskeleler, (b) Hızlı Prototipleme ile hazırlanan iskeleler

 

Sonuç

Doku mühendisliği uygulamaları için biyouyumlu, biyobozunur ve elastik iskelelerin yapımında kullanılmak üzere lizin bazlı poli(esterüretan) sentezlenmiştir. Hazırlanan iskele yapıların yüzeyi toksik etki göstermeksizin iyi hücre yapışması sağlamış ve kemik hücrelerinin (osteoblastların) çoğalmasını desteklemiştir. Üretilen malzemeler in vivo (vücut içi) doku yenileme uygulamalarında aday malzemeler olarak umut vermektedir. Biyomedikal uygulamalarda, malzemelerin kimyasal yapısı, işleme tekniği, hücre ve doku ile etkileşimi çok önemlidir. Bu tür biyomalzemeler, klinik uygulamalardan önce standartlara uygun şekilde üretilebilmeli ve yine standartlara uygun şekilde sitotoksisite deneylerine tabi tutulmalı ve medikal uygulanabilirliği onaylanmalıdır. Ülkemizde medikal ve doku mühendisliği amaçlı kullanılabilecek biyomalzemelerin sentezi, tasarımı, üretimi ve biyouyumluluğu konularında çok yoğun araştırmalar yürütülmektedir.

Teşekkür

Bu çalışma, AB 6. ÇP NoE EXPERTISSUES (NMP3 CT2004500283) Fibrocell projesi, TÜBİTAK TBAG 105T508 Nanobiomat projesi ve ODTÜ BAP tarafından desteklenmiştir.

Kaynaklar

1) Parrag I.C., Woodhouse K.A. Development of biodegradable polyurethane scaffolds using amino acid and dipeptide-based chain extenders for soft tissue engineering. J Biomater Sci Polym Ed. 21:843-62 (2010).

2) Hasirci N., Aksoy E.A., Synthesis and modification of polyurethanes for medical applications. High Perform. Polym. 19:621-637 (2007).

3) Güney A., Hasirci N., Properties and phase segregation of crosslinked PCL-based polyurethanes, J. Appl. Polym. Sci. 131:1 (2014).

4) Abraham G.A., Marcos-Fernández A., Román J.S. Bioresorbable poly(ester-ether urethane)s from L-lysine diisocyanate and triblock copolymers with different hydrophilic character. J. Biomed. Mater. Res A. Mar 15:729-36 (2006).

5) Kiziltay A., Fernandez A.M, Roman J.S., Hasirci V., Hasirci N. Lysine based poly(ester-urethane) Films for Tissue Engineering Applications. J. Biomater. Tissue Eng. 2:143-153 (2012).

6) Kiziltay A., Marcos-Fernandez A., Roman J.S., Sousa R.A., Reis R.L., Hasirci V., Hasirci N. Poly(ester-urethane) scaffolds: effect of structure on properties and osteogenic activity of stem cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. Article first published online: 26 DEC 2013, DOI: 10.1002/ term.1848 (2013).